Có hai lựa chọn để phát hiện mục tiêu khi thực hiện qPCR – bạn có thể sử dụng thuốc nhuộm hoặc phát hiện dựa trên đầu dò. Hôm nay chúng ta sẽ đi sâu vào thế giới của qPCR dựa trên thuốc nhuộm, được Russell Higuchi [1] phát minh vào đầu những năm chín mươi và vẫn được sử dụng hàng ngày trên toàn thế giới.
qPCR dựa trên thuốc nhuộm là gì?
qPCR dựa trên thuốc nhuộm là một tùy chọn qPCR tiết kiệm chi phí, đo sự khuếch đại DNA sợi đôi trong quá trình PCR (Phản ứng chuỗi polymerase) dựa trên việc phát hiện huỳnh quang của thuốc nhuộm liên kết DNA [ 1 ]. Ngoài hỗn hợp qPCR, nước không có nuclease và DNA, nó chỉ yêu cầu hai đoạn mồi đặc hiệu cho trình tự, khiến nó trở thành một tùy chọn tiết kiệm chi phí khi xem xét một số lượng lớn các mục tiêu.
Nó hoạt động thế nào?
Như đã đề cập trước đó, qPCR dựa trên thuốc nhuộm sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang liên kết DNA. Trước khi liên kết với DNA, thuốc nhuộm thể hiện huỳnh quang nền thấp. Trong quá trình khuếch đại, thuốc nhuộm liên kết với bất kỳ sản phẩm DNA sợi đôi nào được tìm thấy trong mẫu. Điều này dẫn đến sự gia tăng huỳnh quang tỷ lệ thuận với sự gia tăng của các amplicon PCR có mặt tại mỗi chu kỳ. [1]
Huỳnh quang được đo sau mỗi chu kỳ PCR. Chu kỳ ngưỡng (Ct), còn được gọi là chu kỳ định lượng (Cq), đạt được khi đủ thuốc nhuộm huỳnh quang liên kết với DNA sợi đôi để có huỳnh quang cao hơn huỳnh quang nền. Giá trị Ct được sử dụng để định lượng lượng DNA mục tiêu trong mẫu (mức Ct càng thấp thì lượng DNA mục tiêu trong mẫu càng lớn). [ 2][3]
qPCR dựa trên thuốc nhuộm được coi là hiệu quả về mặt chi phí, vì chỉ cần hai đoạn mồi đặc hiệu cho mỗi mục tiêu, nhưng vì các đoạn mồi này là cách duy nhất để xác định tính đặc hiệu của phản ứng nên nó không đặc hiệu bằng PCR thông thường hoặc qPCR dựa trên đầu dò [ 4 ]. Tuy nhiên, nó rẻ hơn nhiều so với việc phải mua các đoạn mồi và đầu dò cho qPCR dựa trên đầu dò.
Vấn đề chính với các đoạn mồi trong qPCR dựa trên thuốc nhuộm là chúng có xu hướng tạo thành các đoạn mồi dimer hoặc các đoạn khuếch đại không đặc hiệu [ 5 ][ 6 ]. Thật không may, thuốc nhuộm sẽ phát hiện và liên kết với bất kỳ DNA mạch đôi nào, bao gồm tất cả các mục tiêu ngoài mục tiêu, tức là các sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu. Điều này có thể dẫn đến việc định lượng không chính xác trình tự mục tiêu. [ 5 ]
Tuy nhiên, có một cách đơn giản để xác định vấn đề. Có thể so sánh nhiệt độ nóng chảy của các sản phẩm khuếch đại bằng cách sử dụng đường cong nóng chảy. Điều này cho phép xác minh tính đặc hiệu của khuếch đại và kiểm tra sự hiện diện của các sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu [ 6 ].
Phân tích đường cong nóng chảy dựa trên thực tế là các sợi DNA mạch đôi khác nhau tách ra khỏi nhau ở các nhiệt độ khác nhau tùy thuộc vào nhiều yếu tố (hàm lượng GC, SNP, v.v.). Đường cong nóng chảy được tạo ra khi sản phẩm PCR được đun nóng và các sợi đôi bắt đầu tách ra, trong thời gian đó thuốc nhuộm huỳnh quang cũng tách ra khỏi các sợi, do đó có thể phát hiện ra sự giảm huỳnh quang. [ 6]
Sau khi máy qPCR hoàn tất việc thu thập dữ liệu, bạn sẽ nhận được một sơ đồ khuếch đại trực quan hóa sự tích tụ DNA trong suốt thời gian của qPCR. Các đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang từ thuốc nhuộm được chuẩn hóa thành tín hiệu của thuốc nhuộm tham chiếu thụ động (ví dụ ROX) trừ đi đường cơ sở do máy qPCR tạo ra [2][3]. Nó sẽ trông giống như thế này:
.png)
Ưu và nhược điểm của qPCR dựa trên thuốc nhuộm là gì?
Có nhiều lý do tại sao qPCR dựa trên thuốc nhuộm lại phổ biến trong giới khoa học. Sau đây là một số lý do:
- Chi phí (chỉ 2 mồi) – một lựa chọn tiết kiệm hơn so với qPCR dựa trên đầu dò.
- Dễ thiết kế hơn qPCR dựa trên đầu dò. Một lần nữa, bạn chỉ cần 2 mồi cho phương pháp trước. Phương pháp sau yêu cầu 2 mồi và một đầu dò được đặt rất cụ thể.
- Có thể phát hiện ra lỗi ngoài gen quan tâm, không giống như qPCR dựa trên đầu dò. Vì vậy, có thể tối ưu hóa thí nghiệm và có kết quả tốt hơn vào lần sau.
Thật không may, giống như mọi phương pháp khác, qPCR dựa trên thuốc nhuộm không lý tưởng cho mọi thiết kế thử nghiệm. Sau đây là một số nhược điểm:
- Không thể thực hiện ghép kênh.
- Nó có độ đặc hiệu thấp.
Có những lựa chọn thuốc nhuộm nào cho qPCR dựa trên thuốc nhuộm?
Phần quan trọng nhất của qPCR dựa trên thuốc nhuộm tất nhiên là thuốc nhuộm. Việc chọn đúng thuốc nhuộm có thể còn khó hơn cả việc chọn một diện mạo mới cho bản thân tại tiệm làm tóc. Thật không may, chúng tôi không thể giúp bạn về kiểu tóc, nhưng chúng tôi có một số khuyến nghị để chọn đúng thuốc nhuộm cho thí nghiệm qPCR của bạn.
Thuốc nhuộm cổ điển và có lẽ được sử dụng thường xuyên nhất là SYBR® Green [ 7] . Tuy nhiên, có những lựa chọn tốt hơn, có thể chưa phổ biến nhưng đáng để cân nhắc. Một trong số đó là EvaGreen®, có quang phổ tương tự như SYBR® Green, vì vậy không cần phải thay đổi bất kỳ cài đặt quang học nào khi sử dụng nó [8]. EvaGreen® rất ổn định ở nhiệt độ phòng và cả trong điều kiện PCR [8 ] . Nó ít ức chế hơn về mặt nồng độ – có thể tăng nồng độ thuốc nhuộm để tăng huỳnh quang mà không làm hỏng phản ứng [8. Điều này cũng cho phép phân tích nóng chảy có độ phân giải cao tốt hơn [8]. Hơn nữa, thuốc nhuộm EvaGree n® có ít nền hơn SYBR® Green I do cơ chế liên kết DNA “giải phóng theo yêu cầu” mới lạ của nó [9]. Trên hết, EvaGreen® cũng được coi là ít độc hại hơn và an toàn hơn với môi trường so với SYBR® Green [9].
Một lựa chọn khác là SolisGreen® cũng chia sẻ các đặc tính quang phổ với các thuốc nhuộm qPCR thường dùng khác. Các hỗn hợp qPCR dựa trên thuốc nhuộm SolisGreen® có độ nhạy cao và hiệu suất tăng lên (huỳnh quang sáng hơn) với nồng độ mục tiêu thấp cho thấy độ chính xác được cải thiện và ít sai lệch hơn giữa các bản sao kỹ thuật.
Tất nhiên, còn có nhiều loại thuốc nhuộm khác để lựa chọn, nhưng tất cả các sản phẩm Solis BioDyne đều dựa trên EvaGreen® hoặc SolisGreen® để đảm bảo độ ổn định, hiệu quả và tính bền vững của sản phẩm.
Các lựa chọn của EvaGreen®:
HOT FIREPol ® EvaGreen ® qPCR Mix Plus
HOT FIREPol ® EvaGreen ® qPCR Supermix
HOT FIREPol ® EvaGreen ® HRM Mix
Các tùy chọn của SolisGreen®:
HOT FIREPol ® SolisGreen qPCR Mix
SolisFAST ® SolisGreen ® qPCR Mix
Bộ SOLIScript ® 1 bước SolisGreen ®
Tài liệu tham khảo:
[1] Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G. et al. Kinetic PCR Analysis: Real-time Monitoring of DNA Amplification Reactions. Nat Biotechnol 11, 1026–1030 (1993). https://doi.org/10.1038/nbt0993-1026
[2] Schefe, J.H., Lehmann, K.E., Buschmann, I.R. et al. Quantitative real-time RT-PCR data analysis: current concepts and the novel “gene expression’s C T difference” formula. J Mol Med 84, 901–910 (2006). https://doi.org/10.1007/s00109-006-0097-6
[3] Article 5: qPCR data analysis – Amplification plots, Cq and normalisation. (2009). Retrieved 1 November 2021, from https://www.europeanpharmaceuticalreview.com/article/725/article-5-qpcr-data-analysis-amplification-plots-cq-and-normalisation/
[4] Udvardi, M. K., Czechowski, T., & Scheible, W. R. (2008). Eleven golden rules of quantitative RT-PCR. The Plant cell, 20(7), 1736–1737. https://doi.org/10.1105/tpc.108.061143
[5] Raso, A., & Biassoni, R. (2014). Twenty Years of qPCR: A Mature Technology? Quantitative Real-Time PCR, 1–3.doi:10.1007/978-1-4939-0733-5_1
[6] Ririe, K. M., Rasmussen, R. P., & Wittwer, C. T. (1997). Product Differentiation by Analysis of DNA Melting Curves during the Polymerase Chain Reaction. Analytical Biochemistry, 245(2), 154–160.doi:10.1006/abio.1996.9916
[7] Zipper, H., Brunner, H., Bernhagen, J., & Vitzthum, F. (2004). Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic acids research, 32(12), e103. https://doi.org/10.1093/nar/gnh101
[8] Mao, F., Leung, WY. & Xin, X. Characterization of EvaGreen and the implication of its physicochemical properties for qPCR applications. BMC Biotechnol 7, 76 (2007). https://doi.org/10.1186/1472-6750-7-76
[9] Selvaraj V., Maheshwari Y., Hajeri S., Yokomi R. (2019) Droplet Digital PCR for Absolute Quantification of Plant Pathogens. In: Khurana S., Gaur R. (eds) Plant Biotechnology: Progress in Genomic Era. Springer, Singapore. https://doi.org/10.1007/978-981-13-8499-8_25
