Làm thế nào để bảo tồn RNA?

Cho dù bạn đang nghiên cứu vật liệu di truyền của thực vật, động vật hay vi-rút, thì thí nghiệm thường bắt đầu bằng việc chiết xuất RNA từ vật liệu mẫu. Sẽ vô cùng hữu ích nếu chiết xuất được toàn bộ RNA thay vì để chúng bị RNase phá hủy trước khi bắt đầu bước tổng hợp cDNA. Nhưng làm sao chúng ta có thể bảo vệ RNA khi RNase ở khắp mọi nơi xung quanh? Hãy cùng tìm hiểu nhé!

RNase là gì?

RNase thực hiện nhiều vai trò sinh học và chúng nằm trong số các enzyme được tế bào tiết ra phổ biến nhất. Chúng phân hủy RNA thành các thành phần nhỏ hơn và cũng là một phần của quá trình xử lý RNA, thay đổi và điều hòa biểu hiện gen [1][2][3][4]. Mặc dù RNase có thể phá hỏng thí nghiệm của bạn bằng cách làm tạp nhiễm và phân giải RNA mà bạn đang ử dụng, nhưng chúng vẫn cần thiết cho sự sống nói chung. Ví dụ, chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình trưởng thành của các phân tử RNA [1][2][5] và được đưa vào cơ chế tự không tương thích của thực vật [6]. Chúng là hàng phòng thủ đầu tiên chống lại vi-rút RNA và cũng là một phần của các chiến lược miễn dịch tế bào tiên tiến hơn (ví dụ như can thiệp RNA) và nhiều hơn nữa [1][7].
Bạn có thể nghĩ rằng sau khi tinh chế RNA, không có RNase nào có thể gây ra vấn đề cho thí nghiệm, nhưng RNase có thể dễ dàng xâm nhập vào mẫu từ phòng thí nghiệm. Ví dụ, nếu bạn chạm tay trần vào mẫu hoặc nếu bạn chưa vệ sinh pipet đúng cách hoặc thậm chí RNAse có thể đi từ máy điều hòa không khí. 
Vì vậy, cách duy nhất để có được kết quả tuyệt vời, tránh nhiễm RNase và phân hủy RNA là sử dụng chất ức chế RNase trong khi thực hiện thí nghiệm PCR. 

Chất ức chế RNase là gì?

Chất ức chế RNase ức chế hoạt động của RNase bằng cách tạo phức hợp với RNase và ngăn chặn hoạt động, vì thế đóng vai trò quan trọng trong tất cả các quá trình tương tự đã được đề cập ở trên [8]. Chức năng ức chế RNase rất quan trọng đối với nghiên cứu và chẩn đoán trong việc bảo vệ các mẫu nghiên cứu RNA khỏi sự phân hủy của RNase [9]. 

Làm thế nào để tránh nhiễm bẩn trong quá trình chiết xuất RNA?

Mức độ phòng ngừa mà bạn phải thực hiện phụ thuộc vào mức độ nguy cơ nhiễm. Ví dụ, làm việc trong bệnh viện có xu hướng đòi hỏi phải khử trùng nhiều hơn so với làm việc ngoài thực địa. 
Các yêu cầu tiêu chuẩn:
  1. Sử dụng găng tay sạch. Hãy nhớ rằng găng tay của bạn không sạch sau khi bạn mở tủ lạnh hoặc chạm vào thứ gì đó bên ngoài vùng vô trùng.
  2. Làm sạch tất cả các bề mặt và pipet bằng dung dịch ethanol 70% trước khi bắt đầu thí nghiệm. Ngoài ra còn có các sản phẩm khử nhiễm khác nhau có thể phá hủy RNase khi tiếp xúc, bạn có thể sử dụng để làm sạch.
  3. Đóng chặt ống nghiệm, chai lọ và hộp đựng pipet khi không sử dụng.
  4. Luôn sử dụng nước Nulease Free khi thực hiện thí nghiệm và khi vệ sinh thiết bị phòng thí nghiệm. Nhiễm chéo có thể dễ dàng đến từ nước không sạch và vật tư phòng thí nghiệm.
  5. Nếu có thể, hãy tiến hành thí nghiệm trong tủ thao tác PCR và tủ ATSH cấp 2.
Để an toàn hơn, bạn có thể hấp tiệt trùng tất cả các đầu và ống trước khi sử dụng. Ngoài ra, hãy nhớ giữ cho pipet của bạn sạch sẽ và nếu có thể, chỉ đặt đầu tip pipet vào ống Fancol,…, không phải phần còn lại của pipet. Một lựa chọn khác là sử dụng các đầu tip và pipet đặc biệt chỉ dành cho các thí nghiệm RNA.

Các bước tiếp theo với RNA

Sau khi RNA của bạn được tách chiết, lựa chọn tốt nhất để tránh nhiễm là sử dụng thuốc thử có chứa chất ức chế RNase. Chúng tôi có chất ức chế ribonuclease dựa trên protein được thiết kế in silico RiboGrip® , chất này có tác dụng bất hoạt RNase A, B và C. Chất này hoạt động trong ít nhất 1 giờ ở 60°C và có độ ổn định cao hơn ở nhiệt độ phòng, nhờ công nghệ Stability TAG, không mất hoạt tính trong tối đa 1 tháng. Tuy nhiên, RNA vẫn nên được giữ trong đá trong khi thực hiện thí nghiệm vì nó dễ bị phân hủy. (Để bảo quản lâu dài, RNA tốt nhất nên được bảo quản trong tủ đông -80 °C.)

Làm thế nào để phân tích mục tiêu RNA bằng sản phẩm của Solis BioDyne?

Ở đây bạn có hai lựa chọn, hoặc là bạn có thể thực hiện tổng hợp cDNA sau đó là qPCR hoặc PCR hoặc thực hiện cả hai trong một bước. Nếu bạn muốn có kết quả nhanh với nguy cơ nhiễm thấp hơn, chúng tôi khuyên bạn nên thực hiện phương án thứ 2. Nếu bạn muốn sử dụng cDNA trong tương lai cho các thí nghiệm khác, thì phương án đầu tiên có thể tốt hơn cho bạn.
Thực hiện thí nghiệm với các sản phẩm One-step của chúng tôi cực kỳ dễ dàng:
  1. Để RNA không bị phân hủy, hãy bảo quản nó trong đá.
  2. Trộn các thuốc thử (nếu có nhiều hơn một) bằng cách lắc nhẹ, sau đó ly tâm trong thời gian ngắn.
  3. Thêm Primer (và Probe) vào hỗn hợp. (Giảm thiểu tiếp xúc với ánh sáng đối với Primer và Probe)
  4. Đừng quên cho thêm nước không chứa nuclease.
  5. Cuối cùng, thêm RNA mẫu.
  6. Để đảm bảo mọi thứ đều ổn, hãy sử dụng mẫu đối chứng (mẫu không chứa RNA).
  7. Trộn đều hỗn hợp phản ứng, sau đó ly tâm trong thời gian ngắn.
  8. Phân phối lượng hỗn hợp thích hợp vào các giếng PCR.
  9. Thu thập và phân tích dữ liệu theo hướng dẫn cụ thể của từng thiết bị. Kiểm tra bản sao và sơ đồ khuếch đại. Thiết lập đường cong chuẩn nếu muốn định lượng tuyệt đối.

Tôi có thể sử dụng sản phẩm nào để phân tích RNA của mình?

Để thuận tiện cho bạn, RiboGrip® đã có trong tất cả các sản phẩm RT-(q)PCR và hỗn hợp tổng hợp cDNA của chúng tôi, do đó bạn có thể chắc chắn rằng không có sự nhiễm bẩn RNase trong thí nghiệm của bạn và bạn không phải mua thêm bất kỳ sản phẩm nào. Tuy nhiên, bạn cũng có thể mua RiboGrip® riêng lẻ ở dạng thông thường và không chứa glycerol .

Các lựa chọn RT-PCR:

  • SolisFAST® 1-step RT-PCR Kit with UNG – tổng hợp cDNA có độ nhạy và độ đặc hiệu cao cùng phản ứng Endpoint PCR trong một ống duy nhất.
  • SolisFAST® 1-step RT-PCR Kit with UNG Ready to Load – tổng hợp cDNA nhạy và có độ đặc hiệu cao và Endpoint PCR  trong một ống duy nhất. Phiên bản Sẵn sàng để tải để hợp lý hóa quy trình điện di gel của bạn.

Các lựa chọn RT-qPCR dựa trên thuốc nhuộm:

  • SOLIScript® 1-step SolisGreen® Kit 2.0 – tổng hợp cDNA có độ nhạy cao và qPCR dựa trên thuốc nhuộm trong một phản ứng duy nhất. Giải pháp lý tưởng cho phân tích RNA hiệu quả về chi phí và thông lượng cao.

Các tùy chọn RT-qPCR dựa trên đầu dò:

  • SOLIScript® Fast 1-step RT-qPCR Mix with UNG – Thuốc thử RT-qPCR 1-Step trong một lọ đơn tiện lợi. Bao gồm enzyme UNG để ngăn ngừa nhiễm bẩn và kết quả dương tính giả. Khả năng ghép kênh cao và khả năng chịu chất ức chế cho phép thiết kế thí nghiệm linh hoạt.
  • SOLIScript® 1-step Probe Kit – tổng hợp cDNA và qPCR nhạy và có độ đặc hiệu cao trong một ống duy nhất. Phù hợp với các chu trình ROX và no-ROX.
  • SOLIScript® 1-step Multiplex Probe Kit – tổng hợp cDNA nhạy và có độ đặc hiệu cao và qPCR dựa trên đầu dò trong một ống duy nhất. Giải pháp lý tưởng cho phân tích RNA thông lượng cao.

Các lựa chọn tổng hợp cDNA:

  • FIREScript® RT cDNA synthesis KIT – bộ tổng hợp cDNA linh hoạt và mạnh mẽ chứa tất cả các thuốc thử bạn cần để tổng hợp cDNA sợi đầu tiên. Các thành phần riêng lẻ cho phép tối ưu hóa xét nghiệm toàn diện.
  • FIREScript® RT cDNA synthesis MIX – dạng sản phẩm toàn diện và tiện lợi nhất cho tổng hợp cDNA sợi đầu tiên. Phiên mã ngược dựa trên MMLV biến đổi gen với khả năng chịu nhiệt tăng lên và hiệu suất được cải thiện ở nhiệt độ cao. Hỗn hợp enzyme kết hợp (FIREScript ®  và RiboGrip ® ) và hỗn hợp phản ứng trước trong các ống riêng biệt cho phép bạn chọn tùy chọn mồi phù hợp nhất.
  • SOLIScript® RT cDNA synthesis KIT – một bộ tổng hợp cDNA linh hoạt và có độ đặc hiệu cao, chứa tất cả các thuốc thử bạn cần để tổng hợp cDNA sợi đầu tiên. Các thành phần riêng lẻ cho phép tối ưu hóa xét nghiệm toàn diện. 
  • SOLIScript® RT cDNA synthesis MIX –  enzyme phiên mã ngược chịu nhiệt, được thiết kế in silico mới với hoạt động RNase H giảm. Định dạng sản phẩm toàn diện và thuận tiện nhất để tổng hợp cDNA sợi đầu tiên bằng cách sử dụng các đoạn mồi đặc hiệu gen. Một mix enzyme kết hợp (SOLIScript ®  và RiboGrip ® ) và một premix reaction trong các ống riêng biệt.

Trên đây là các sản phẩm Solis Biodyne được thiết kế riêng và chuyên biệt phù hợp nhiều mục đích khác nhau. Quý khách có thể tham khảo thêm trên trang web hoặc liên hệ trực tiếp đến chúng tôi để được hỗ trợ sớm nhất.

References:

[1] Arraiano, C. M., Andrade, J. M., Domingues, S., Guinote, I. B., Malecki, M., Matos, R. G, Moreira, R. N., Pobre, V., Reis, F. P., Saramago, M.; Silva, I. J., Viegas, S. C. (2010). The critical role of RNA processing and degradation in the control of gene expression. FEMS Microbiology Reviews, 34(5), 883–923, https://doi.org/10.1111/j.1574-6976.2010.00242.x
[2] Snow, S., Bacon, E., Bergeron, J., Katzman, D., Wilhelm, A., Lewis, O., Syangtan, D., Calkins, A.; Archambault, L., Anacker, M. L., Schlax, P. J. (2020). Transcript decay mediated by RNase III in Borrelia burgdorferi. Biochemical and Biophysical Research Communications, 529(2), 386–391. doi:10.1016/j.bbrc.2020.05.201
[3] Wellner, K., Betat, H., Mörl, M. (2018). A tRNA’s fate is decided at its 3′ end: Collaborative actions of CCA-adding enzyme and RNases involved in tRNA processing and degradation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Gene Regulatory Mechanisms, 1861(4), 433-441. doi: 10.1016/j.bbagrm.2018.01.012.
[4] Kang, S. O., Caparon, M. G., Cho, K. H. (2010). Virulence Gene Regulation by CvfA, a Putative RNase: the CvfA-Enolase Complex in Streptococcus pyogenes Links Nutritional Stress, Growth-Phase Control, and Virulence Gene Expression. Infection and Immunity, 78(6), 2754–2767. doi:10.1128/IAI.01370-09
[5] Reiner, R., Ben-Asouli, Y., Krilovetzky, I., Jarrous, N. (2006). A role for the catalytic ribonucleoprotein RNase P in RNA polymerase III transcription. Genes & development, 20(12), 1621–1635. https://doi.org/10.1101/gad.386706
[6] Williams, J. S., Wu, L., Li, S., Sun, P., Kao, T.-H. (2015). Insight into S-RNase-based self-incompatibility in Petunia: recent findings and future directions. Frontiers in Plant Science, 6(), –. doi:10.3389/fpls.2015.00041
[7] Ilinskaya, O. N., & Mahmud, R. S. (2014). Ribonucleases as antiviral agents. Molecular biology, 48(5), 615–623. https://doi.org/10.1134/S0026893314040050
[8] Yakovlev, G. I., Mitkevich, V. A., Makarov, A. A. (2006). Ribonuclease Inhibitors. Molecular Biology, 40(6): 867-874. DOI: 10.1134/S0026893306060045
[9] Dickson, K. A., Haigis, M. C., Raines, R. T. (2005). Ribonuclease inhibitor: structure and function. Progress in nucleic acid research and molecular biology, 80, 349–374. https://doi.org/10.1016/S0079-6603(05)80009-1
Mời Quý Khách Đánh Giá